용출 및 재생

크로마토그래피 매질이 소진되면 용출해야 합니다. 기본 원리는 활성이 더 높은 이온이나 작용기를 이용하여 목표 물질을 탈착시키는 것입니다. 흡착제마다 활성이 다르므로, 단백질을 용출하기 위해서는 적절한 용출액을 선택해야 합니다.  크로마토그래피 매체 .

이온 교환 크로마토그래피에서 용출하는 방법은 크게 세 가지가 있습니다.
첫 번째 방법은 동시 용출법입니다. 용출액으로는 묽은 산, 알칼리 또는 염 용액을 사용할 수 있으며, 적절한 유기 용매도 사용할 수 있습니다. 주로 염 용액이 사용되며, 제형은 목표 물질과 최종 제품의 특성에 따라 선택됩니다. 흡착 대상 물질은 단일 물질이 아닌 경우가 많고, 각 물질의 전하가 다르며, 매질과의 결합력도 다릅니다. 동일한 용출액을 사용하더라도 쉽게 치환되는 물질이 먼저 매질에서 용출되고, 결합력이 강한 물질은 용출 후 분획을 통해 수집되어 다양한 물질을 비교적 순수한 제품으로 분리할 수 있습니다. 이 방법은 목표 제품의 특성이 잘 알려져 있거나 분석 대상 물질을 분리할 때 주로 사용됩니다.

두 번째 방법은 단계적 용출, 즉 염 용액의 농도를 다르게 하여 용출하는 것입니다. 교환 흡착 과정에서 다양한 단백질이 흡착되는데, 일정한 용출 조건을 사용하면 모든 성분을 제대로 분리하기 어려운 경우가 있어 용출 조건을 변경해야 합니다. 이때 단계적 용출을 통해 각기 다른 용출액이나 pH가 다른 용출액을 단계적으로 사용하여 용출할 수 있으며, 용출액의 농도와 산성도에 따라 각기 다른 용출 피크를 얻을 수 있습니다. 즉, 특정 염 농도에서는 특정 단백질을 얻을 수 있고, 다른 염 농도에서는 다른 특정 단백질을 얻을 수 있습니다. 이러한 단계적 용출 방법은 특히 대규모 생산에 적합하며, 조작과 제어가 용이하여 특정 단백질의 분리에 효과적입니다.

세 번째 유형은 연속 기울기 용리법으로, 용리액의 이온 강도 또는 pH를 특정 선형 변화에 따라 변화시키는 방식입니다(일반적으로 pH를 변화시키는 용리법을 사용하는 특수한 경우에만 사용됨). 이 과정에서 다양한 단백질들이 순차적으로 치환되어 여러 단백질 성분을 얻을 수 있으며, 일반적으로 단백질 꼬리가 남지 않습니다. 기울기 용리법은 이온 교환 크로마토그래피에서 가장 흔하게 사용되는 용리법이며, 용리 능력이 가장 강력한 방법으로, 전하 특성이 유사한 유사 성분들을 용리하는 데 적합합니다.

용출 과정에서는 병류 용출 또는 역류 용출을 사용할 수 있습니다. 병류 용출은 정방향 용출이라고도 하며, 용출액의 흐름 방향이 작동 유체의 흐름 방향과 동일합니다. 역류 용출은 역방향 용출이라고도 하며, 용출액의 흐름 방향이 작동 유체의 흐름 방향과 반대입니다. 공급액이 교환탑을 통해 위에서 아래로 교환 및 흡착되면, 교환탑 상층의 흡착물 농도가 하층보다 높아지고, 용출액이 아래에서 위로 역탈착되면 용출 목적을 더욱 효율적으로 달성할 수 있습니다. 그러나 역용출 공정은 정방향 용출보다 훨씬 복잡하기 때문에 대부분 정방향 용출을 기반으로 합니다.

이온 교환 크로마토그래피에서 용리액의 유속은 분리능에 영향을 미치며, 일반적으로 용리 속도는 일정하게 유지됩니다. 일반적으로 용리 속도가 느릴수록 분해능이 좋지만, 용리 속도가 너무 느리면 분리 시간이 길어지고 시료 확산, 스펙트럼 피크 폭 넓어짐, 분해능 저하 등의 부작용이 발생할 수 있으므로 실제 상황에 따라 적절한 용리 속도를 선택해야 합니다. 용리 피크가 특정 영역에 집중되어 겹치는 경우에는 분해능을 높이기 위해 그라디언트 범위를 적절히 줄이거나 용리 속도를 낮춰야 합니다. 반대로 분해능은 좋지만 용리 피크가 너무 넓은 경우에는 용리 속도를 적절히 높여야 합니다.